耳聋基因诊断--转化医学推动耳科学发展的范例

  转化医学（Translational Medicine）是一个新兴的多学科融合的领域，是基因组和生物信息学革命的时代产物，主旨在于促进基础医学研究向临床应用的转化，同时根据临床医学的需求提出前瞻性的应用基础研究方向。随着研究深度和广度的增加，临床和基础研究间的屏障也在增大，这使得新知识向临床的渗透以及向基础研究的反馈都更为困难。作为致力于克服或减少这种困难的新模式，转化医学的核心就是在从事基础科学发现的研究者和了解病人需求的医生之间建立起有效的联系，特别集中在基础分子生物医学研究向最有效和最合适的疾病诊

断、治疗和预防模式的转化。

        耳聋是人类最常见的致残性疾病之一，是全人类最大的苦难之一。人类基因组计划的开展促进了遗传学与临床医学的结合，耳聋基因诊断的应运而生对明确耳聋病因、预防耳聋发生有着重要意义。欧美统计表明，每1000 个新生儿中，就有1 名听力障碍患者。在我国，听力言语残疾者达2780万以上，其中单纯听力残疾2004万，占残疾人总数的24.16% ，每年新生3万聋儿。在大量的迟发性听力下降患者中，有许多患者由于自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。目前的研究推测60%重度耳聋的发病与遗传有关，另外40%可能与环境因素有关。

  遗传性耳聋具有广泛的遗传异质性，其中30%为综合征性耳聋，70%为非综合征性耳聋，主要涉及四种遗传方式：常染色体显性（DFNA,15~20%）、常染色体隐性（DFNB,80%）、性连锁（DFNX-linked,DFNYlinked,1%）和线粒体遗传性耳聋（1%）。一般来说，常染色体隐性遗传性耳聋表现为先天性聋或语前聋，常染色体显性遗传性耳聋多表现为语后聋或渐进性听力下降。自上世纪80年代以来，耳聋的遗传病因学研究取得了很大进展，至今已有120余个耳聋基因被克隆或鉴定，但还有很多耳聋表型的致病基因不清楚。

  本文通过对中国耳聋基因诊断的10年发展来解析转化医学推动耳科发展的的过程及取得的成果。

1 中国遗传性耳聋研究现状

  在我国，遗传性耳聋研究始于70年代中期，1976年吉林医科大学及中国人民解放军81112部队聋哑研究组提出了链霉素中毒耳聋与家族易感性有关，1987年胡丹宁等在上海调查了48万余人，发现其中0.59‰为先天性耳聋，先天性遗传性耳聋发病率约0.5%。卜行宽等1987年报道了一个507人的耳聋大家系，后续相关基因的研究发现是与线粒体突变相关的耳聋家系。胡丹宁等1991年首次提出氨基糖苷类药物遗传易感性具有母系遗传的特点。夏家辉等1998年在我国克隆了耳聋相关基因GJB3，实现了本土基因克隆零的突破，开创了国内耳聋基因克隆研究的先河。倪道凤等1999年描述了一个非综合征遗传性、进行性感音神经性耳聋大家系，并提出在这个大家系中的4个分支中有男-男传递的现象，2001年，孔祥银等克隆了遗传性牙本质发育不全Ⅰ型基因(DSPP)，并发现该基因的部分突变还引起进行性高频耳聋，证实了DSPP不仅参与牙本质的发育，特别是牙本质的矿化过程，还参与了听觉系统的发育，建立了牙齿发育和内耳发育之间的联系。

  近10年来，国内耳聋遗产学研究进入快速发展时期。2004年，王秋菊等首次提出了Y-连锁遗传在遗传性耳聋中的存在并证实Y染色体的病理特征为其它染色体片段的插入。赵辉、管敏鑫等首次发现了一个氨基糖甙类药物易感性新突变位点（线粒体12SrRNA 1494 C>T)。2010年，刘学忠、袁慧军等鉴定了1个X-连锁致聋基因PRPS1。2011年程静、袁慧军等鉴定了1个常染色体显性遗传非综合征型致聋基因SMAC/DLABLO，2011年，严旭坤、李华伟、管敏鑫等报道了线粒体异质性T12201C突变与母系遗传迟发性耳聋相关。

  同证婚配是遗传学一个普遍的现象，智商、体态异常的同证婚配会增加连续的遗传性状变异发生几率已成为共识，而耳聋群体的同证婚配在国内外均有极高的比例，在西方许多国家包括美国，尽管聋人的经济和教育状况得到改善，但耳聋患者的出生随着高密度的同证婚配却持续增长，在这些国家的聋人婚姻中，76%属于聋人与聋人结合的婚姻。在中国，虽然没有准确的统计数据，但全国1700所聋哑学校、聋儿康复机构和残疾人福利机构使得聋人的处于同证聚集状态，聋人之间的婚配也是主要的婚姻模式。在基因诊断时代之前，医生很难提供准确的信息来进行遗传咨询。耳聋基因诊断带来的积极意义在于可以为相当部分的耳聋患者（特别是儿童耳聋患者）揭示分子病因，为耳聋家庭提供致病基因的携带状况和遗传规律等信息，从而为耳聋的遗传咨询、产前诊断及出生缺陷预防提供理论基础和依据，真正实现耳聋一级预防。

2 耳聋基因诊断的依据

  遗传性耳聋基因诊断在发达国家已普遍开展，我国的临床耳聋遗传咨询始于2002年。我国拥有巨大的耳聋群体，进化过程造成了人种间遗传差异、人群迁徙和血源融合又导致了局部地区人群遗传背景的复杂化，中国耳聋群体中基因谱和突变谱与西方耳聋人群的存在差异。解放军总医院聋病分子诊断中心是国内最早建立的耳聋专病分子诊断中心，由戴朴教授组建于2003年。

  戴朴课题组历时10年在全国34个省、市、自治区收集感音神经性耳聋病例12789例，病例来源覆盖全国80%区域，包含21个民族，通过系统的耳聋分子流行病学调查，阐释了常见耳聋基因分子遗传机制，为解析遗传性聋复杂的基因型-表型相关性提供了详实数据。调查发现GJB2基因突变是中国聋人群体最常见的致聋因素，21.6%的中国耳聋患者携带GJB2突变（单等位基因突变3.4%，双等位基因突变18.2%）；中国不同民族和不同地区耳聋患者中GJB2突变的携带率差异明显；证实SLC26A4基因突变是中国聋人群体第二常见的致聋因素，是内耳最常见畸形——大前庭水管的致病原因，19.43%的耳聋人群携带SLC26A4基因突变（单等位基因突变1.69%，双等位基因突变17.74%）。在中国聋人群体中，SLC26A4基因的突变热点、突变谱、表型与基因型的对应性等与西方耳聋人群均有明显差别；线粒体DNA突变是导致中国人药物性耳聋的主因，在不同的地区，约2~4.4%的中国聋人携带有线粒体DNAA1555G或C1494T突变；欧美人群中常见的GJB6基因突变在中国并不常见。冯永课题组发现Waardenburg综合征在中国聋人群体中占0.98%，确定MITF、PAX3和SOX10基因为中国人群WS的常见致病基因。

  对于耳聋家系患者的分子诊断，可根据家系遗传特点和表型特点筛查已知耳聋基因，如表现为显性遗传，伴有前庭功能异常的耳聋患者可以检测COCH基因，Usher综合征患者可以检测USH1G、USH2A、USH3A、VLGR1 WHRN 等基因，鳃耳肾综合征患者可检测EYA1、SIX1、SIX5等基因，Alport综合征患者检测COL4A3、COL4A4、COL4A5 等基因。国内学者在一系列耳聋家系中确定了POU3F4、DFNA5、COCH、TMC1、MYO15A 和EYA4等基因的致病突变。初步统计上述相对少见的基因及其突变在耳聋人群中占1.49%。上述研究体现了转化医学“从实验台到病床”（B to B——Bench to Bedside）的理念，为临床耳聋基因诊断、产前诊断及耳聋遗传咨询提供了理论依据和详实的数据。

  目前中国耳聋人群中约近40%能通过基因诊断明确分子病因，按遗传性耳聋占60%计算，约66%的遗传性耳聋已能够得到明确诊断，而另外34%的遗传性耳聋患者的分子病因还待发展更高通量的耳聋基因检测芯片或鉴定新的耳聋基因来明确。对于明确致病基因的聋人或听力正常的致聋基因突变携带者，在其婚配前进行遗传咨询，孕早期进行产前基因诊断，可指导其家庭生育听力正常的孩子。截至2014年1月，解放军总医院聋病分子诊断中心完成耳聋产前诊断674例次，避免了162例耳聋婴儿出生，为这些家庭减轻了负担，取得了良好的经济及社会效益。

3 耳聋基因诊断的方法

  我国学者采用限制性内切酶分析、实时荧光定量PCR、高效液相色谱、芯片、Sanger测序、下一代测序等技术，研发了热点突变快速筛查、高密度耳聋基因突变检测芯片、重点耳聋基因全序列分析和覆盖所有已知耳聋基因的大规模测序等一系列耳聋基因检测方法，保证了耳聋基因诊断和筛查在临床的应用和推广。

       《遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒》可同时检测4个常见耳聋相关基因中的9个国人热点突变，为国内首个获得国家药监局认证的耳聋基因检测产品，该技术将等位基因特异性引物延伸PCR与通用芯片相结合，可以达到快速、敏感、准确诊断的目的，且其操作简单，易于标准化，适于推广，已为临床广泛应用。《线粒体DNA A1555G 突变检测试剂盒》是国内首个用于临床筛查和诊断的药物敏感性耳聋检测试剂盒，应用限制性内切酶酶切方法，检测成本低，准确率达到100%。该试剂盒已获得国家药监局认证，为规模化预防药物性耳聋提供可靠工具。国内外多家单位正在或已经研发出可平行检测更多基因及其位点，甚至覆盖全部耳聋基因外显子的筛查或诊断芯片，具有很好的临床应用前景。例如，美国Emory大学的林曦教授等研发了基于外显子捕捉、生物编码及大规模平行测序技术的131个耳聋基因的检测方法，该项技术获得了美国专利并实现了技术转让，是目前覆盖全、价格相对低廉的已知耳聋基因检测手段。

  随着Illumina、SOLiD 及454等下一代测序平台（NGS）的出现，短时间内完成几百万甚至更多片段的靶向序列捕获及大规模平行测序，可实现对全部外显子、甚至全基因组进行同步检测。外显子组约占全基因组的1%，包含着合成蛋白质及与疾病表型相关的大部分信息。对于已知耳聋基因检测阴性的耳聋患者或家系可通过外显子组测序寻找致聋新基因。但是，外显子组测序面临的问题是如何在巨大的变异信息中筛选出真正的致病突变。这需要对足够多的患者及正常对照携带的变异信息进行甄别，应用生物信息学分析手段，必要时应用基因功能研究方法，最终找出与耳聋表型共分离的基因突变。

4 基于耳聋基因诊断的耳聋出生缺陷三级预防策略

  受宗教、文化等因素的影响，西方国家仅对耳聋进行基因诊断，无耳聋出生缺陷预防的理念。因此，中国的耳聋预防无先例可循。在分子流行病学和致病机制研究的基础上，通过临床耳聋基因诊断实践和一系列大规模耳聋基因筛查项目的实施，戴朴等提出了耳聋出生缺陷三级预防的思路与策略并进行了初步实践。耳聋出生缺陷三级预防即应用基因检测手段，通过药物性聋易感性筛查、聋人夫妇生育指导、孕早期普遍性筛查、青年聋人恋爱前指导，实现耳聋出生缺陷的一级预防；通过产前诊断和干预实现耳聋出生缺陷的二级预防；通过新生儿基因筛查实现耳聋出生缺陷的三级预防。这一预防策略已被国内同行认可，并被北京、上海、成都、大连等市市政府采纳，上述城市成功开展了耳聋高危人群、新生儿耳聋基因筛查，初步形成了以大城市为中心并逐步辐射至全国的耳聋综合防控网络。

5 展望

  健康是人类生存和发展的一个永恒主题，科学技术为提高人类健康水平提供了一条光明的通道，而“转化医学”则是我们打开这条通道的一把金钥匙。耳聋基因诊断是转化医学的一个经典案例，“防患于未然”胜于“亡羊补牢”，这已经是国家发展、社会进步和全民素质提高的必然趋势。耳聋基因诊断的出现和发展推动了耳聋的诊断由影像和听力学水平跃升至分子水平，是耳科学的重大突破。耳聋基因诊断大大提高了临床耳聋患者的确诊率，并为预防耳聋患者的出生和耳聋的发生提供了重要技术保障和实施途径，同时也为耳聋基因治疗的基础和临床研究指明了方向、奠定了基础。

  可以预料的是，通过鉴定更多的耳聋相关基因，完善中国遗传性耳聋基因谱和突变谱的绘制，研发新型的高通量分子诊断平台，加强专业人员培训，建立、健全三级综合预防策略，构建全国性耳聋防控体系以及规模化开展普遍性群体筛查，必将对中国聋病的诊断、治疗和预防产生深远的影响，最终有望实现全面降低药物性耳聋发生率及出生缺陷率的优生优育目标。